Генетики сделали биолюминисценцию живых организмов более яркой
Биолюминесценцию, то есть способность живых организмов самостоятельно светиться без попадания света, изучают уже десятки лет. Чтобы разгадать «формулу света», необходимо выявить все компоненты реакции, включая ферменты, изучить их состав, структуру, гены, которые их кодируют, и синтезировать их.
С задачей справилась команда из 26 ученых — российские специалисты из московского биотехнологического стартапа «Планта», Института биоорганической химии РАН, станции искусственного климата «Биотрон» и их коллега из Австрии. Они использовали механизм, разработанный в Институте биофизики СО РАН (его исследователи в 2020 году смогли «подсветить» табак), и перенесли его на комнатные растения. Об исследовании рассказал портал наука.рф.
Приобрести светящиеся петуньи в России нельзя, так как выращивание и продажа ГМО-растений запрещены. Пока ученые планируют распространять их в других странах и работать над биолюминесценцией роз, орхидей и других растений.
Оптимизация генов биолюминесцентной системы грибов позволила существенно улучшить ее использование в целом ряде гетерологичных систем. Исследование привело к значительному улучшению работы такой системы в различных эукариотических организмах. Ученые подобрали оптимальные аллельные варианты генов светящихся грибов, что позволило создать более яркие биолюминесцентные системы в дрожжах, нескольких видах растений и клетках животных. При этом удалось достичь почти 100-кратного увеличения люминесцентного сигнала для некоторых видов растений.
В частности, исследователи применили направленную эволюцию к ферментам гриба Neonothopanus nambi: люциферазе (nnLuz) и гиспидин-3-гидроксилазе (nnH3H). В результате они выявили множество замен, приводящих к увеличению яркости люминесценции в различных организмах. Кроме того, скрининг ортологичных генов из других видов биолюминесцентных грибов помог обнаружить и успешно использовать фермент гиспидинсинтазы из Mycena citricolor (mcitHispS), превосходящий в эффективности аналог из Neonothopanus nambi (nnHispS). Также ученые описали важность использования фосфопантетеинилтрансферазы NpgA из Aspergillus nidulans. Использование NpgA в генетических конструкциях значительно увеличивало активность HispS и, как следствие, уровень люминесцентного сигнала.
Для оценки совместной работы улучшенных ферментов создали две генетические конструкции: FBP2 (nnHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH и NpgA) и FBP3 (mcitHispS, nnH3H_v2, nnLuz_v4, nnCPH и NpgA). Обе конструкции продемонстрировали значительно более яркую биолюминесценцию по сравнению с контрольной версией (FBP1) в клеточных культурах дрожжей, растений и клетках млекопитающих.
Чтобы проверить, могут ли FBP2 и FBP3 расширить применимость автономной люминесценции для растительной биологии, ученые создали трансгенные линии шести видов растений, которые используются как в научных, так и промышленных целях: модельные растения Arabidopsis thaliana и Nicotiana benthamiana, быстрорастущее древесное растение Populus canadensis, декоративные растения Petunia hybrida и Chrysanthemum morifolium, а также культурный табак — Nicotiana tabacum. В отличие от контроля все экспрессирующие FBP2/FBP3 растения были светящимися, а цветущая петуния продемонстрировала яркую биолюминесценцию, видимую в темноте невооруженным глазом. Ни один из улучшенных версий ферментов биолюминесцентного пути не привел к заметным нежелательным фенотипическим изменениям у растений.
Ученые оценили возможность использования FBP2 и FBP3 для методов оптического анализа без использования профессионального оборудования. Выяснилось, что, используя биолюминесцентные петунию и табак на основе FBP2/FBP3, можно проводить эксперименты с помощью бытовой фотокамеры или даже современных смартфонов.
Также исследователи сравнили работу FBP3 с разными аналогами: оптимизированным бактериальным автолюминесцентным путем iLux, и широко используемыми люциферазами, требующими экзогенного добавления субстрата — люциферазой светлячка и люциферазой NanoLuc. В клеточных культурах растений с FBP3 биолюминесценция была на два-пять порядков ярче по сравнению с iLux, превосходила сигнал от люциферазы светлячка более чем на один порядок, при этом имела уровень люминесценции, сравнимый с NanoLuc. В клетках млекопитающих биолюминесценция FBP3 была примерно в пять раз тусклее, чем у iLux и на два–три порядка ниже по сравнению с люциферазой светлячка и NanoLuc.
Полученные результаты открывают новые возможности для неинвазивного мониторинга физиологических процессов в растениях и животных на протяжении их жизни, уверены специалисты.
Исследование опубликовано в Nature Methods.
Фото: Ekaterina S. Shakhova at al./ Nature Methods (2024)