Направленные мутации увеличили стабильность белков-светофоров
Российские ученые получили стабильный и яркий флуоресцентный белок moxSAASoti, способный менять окраску и интенсивность собственного свечения. Для этого авторы точечно изменили последовательность кодирующего его гена. Ранее все белки, способные «переключать» цвет, были очень чувствительны к окислению и переставали светиться, тогда как новый вариант молекулы не теряет своих свойств.
Флуоресцентные белки представляют собой молекулы, которые при облучении светом определенных длин волн способны сами светиться. Ученые выделяют их из живых организмов, например медуз и кораллов, или искусственно синтезируют в лабораториях. На сегодняшний день существует множество флуоресцентных белков, различающихся по цвету и интенсивности излучения, а также по вариантам изменения окраски. Так, некоторые из них просто переходят из флуоресцентного состояния в нефлуоресцентное, то есть перестают светиться, а другие способны менять цвет излучения с зеленого на красный. Этот процесс протекает, когда белок облучают светом определенной длины волны. Он может быть обратимым и необратимым. Некоторые флуоресцентные белки способны изменять цвет свечения только один раз, что происходит в результате разрыва химических связей. В этом случае структура вещества полностью нарушается и не восстанавливается самостоятельно. Однако есть исключения: например, белок SAASoti, который способен многократно изменять интенсивность своего свечения (включаться-выключаться) и переходить из зеленой формы в красную. Однако SAASoti имеет недостаток: он очень чувствителен к окислителям, которые нарушают его структуру. Например, он окисляется даже на воздухе, что объясняется высокой фотохимической активностью входящих в его состав аминокислотных остатков цистеина.
Ученые из Института биохимии имени А. Н. Баха ФИЦ биотехнологии РАН (Москва) и Московского государственного университета имени М. В. Ломоносова (Москва) с помощью мутаций в гене SAASoti создали варианты флуоресцентного белка с минимальным содержанием цистеина и даже вовсе не несущие его. Для этого авторы получили ДНК с нужными заменами и затем ввели ее в клетки кишечной палочки E. сoli. Таким образом, микроорганизмы получили ген, кодирующий белок SAASoti, и синтезировали на его основе белки, отличающиеся от исходных по строению: в них последовательность аминокислот, которую можно сравнить с очень длинным словом, изменялась на одну, две или большее количество букв. Однако выяснилось, что белки совсем без цистеина остались чувствительными к окислителям, как и исходные варианты. Каждая из вводимых мутаций (замен одной буквы на другую) приводила к интересному изменению свойств белка. Так, например, одиночные точечные мутации вызвали его обесцвечивание, а в результате двухточечного мутагенеза был получен ряд белков с различной степенью яркости окраски. При этом исследователи с помощью математического моделирования могли предварительно предсказать влияние конкретной мутации на свойства белка.
В результате экспериментов было выявлено, что самые благоприятные положения для мутаций — 105 и 117 аминокислота. Соответствующие белки очистили и сравнили между собой по интенсивности окраски, скорости ее изменения, устойчивости к факторам окружающей среды и по другим физико-химическим свойствам. При длине света 520 нанометров наиболее ярким оказался вариант, содержащий в 117-м положении аминокислоту треонин — белок moxSAASoti-T. Кроме того, он в восемь раз быстрее, чем другие варианты, менял цвет.
Исследование поддержано грантом Российского научного фонда. Cтатья First biphotochromic fluorescent protein moxSAASoti stabilized for oxidizing environment; N. K. Marynich, M. G. Khrenova, A. V. Gavshina, I. D. Solovyev & A. P. Savitsky; журнал Scientific Reports, июнь 2022 г.
Фото: сайт Коммерсантъ