Российские ученые разработали новый генетически кодируемый зеленый кальциевый индикатор и изучили его свойства
Флуоресцентные белки, обеспечивающие в природе свечение различных организмов и открытые более полувека назад, в настоящее время являются незаменимым биологическим инструментом, который используется для индикации локализации белков в клетке, визуализации клеток и органелл, контроля фаз клеточного цикла и др. При этом область применения флуоресцентных белков постоянно расширяется, в том числе за счет создания белков с новыми характеристиками и улучшенными свойствами. Результаты исследования опубликованы в журнале Febs Open Bio.
Одним из практических применений флуоресцентных белков является контроль уровня различных клеточных метаболитов (например, кальция). Для этих целей к таким белкам пришивается кальций-связывающий белок (сенсорная часть), который при связывании кальция меняет свою конформацию и, соответственно, спектральные свойства флуоресцентного белка, что дает возможность оценивать концентрацию метаболита. В частности, такие генетически-кодируемые (т.е. закодированные в последовательности ДНК) кальциевые индикаторы являются незаменимым инструментом для визуализации активности нейронов и передачи кальциевых сигналов в живых клетках.
К настоящему моменту разработан большой спектр кальциевых сенсоров на основе различных кальций-связывающих белков – вариантов кальмодулина и тропонина С. При этом белки тропонина С, несмотря на меньший размер и вдвое меньшую способность связывания ионов кальция, имеют и существенный недостаток: низкую яркость или ограниченный контраст.
Научный коллектив, состоящий из ученых НИЦ «Курчатовский институт», ФИЦ Биотехнологии РАН, МФТИ, ИБХ РАН и других научных организаций из России и Уэстлейкского университета в Китае, использовал широкий спектр молекулярно-биологических, физико-химических и структурных методов для разработки улучшенной версии зеленого флуоресцентного индикатора на основе тропонина C рыбы-жабы. В частности, для увеличения яркости и динамического диапазона был использован метод направленной эволюции, а для выяснения влияния окружающих хромофор (флуоресцирующая часть флуоресцентных белков) аминокислотных остатков на свойства индикатора была получена и исследована пространственная структура последнего.
Разработанный индикатор YTnC2 имел молекулярную яркость в 5,7 раза выше, а контраст – в 6,4 раза больше по сравнению с исходной версией данного флуоресцентного индикатора. Таким образом, на сегодняшний день YTnC2 является лучшим зеленым кальциевым индикатором на основе тропонина С, оптимизированным для визуализации кальциевой активности нейронов как в цитозоле, так и внутри митохондрий.
Полученные результаты могут быть использованы для исследования связей между нейронами в живом организме, что позволит пролить свет на взаимосвязи и роль нервных клеток в таких процессах, как пластичность, сенсомоторная интеграция, память и обучение.
Фото: ФИЦ Биотехнологии РАН